РЕНАЛЬНЫЕ И НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПЕРФТОРАНА НА МОДЕЛИ ТОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ПОЧЕК У КРЫС

И.В.Борисова, С.Ю.Штрыголь
Ивановская государственная медицинская академия

Почечная недостаточность относится к одной из наиболее опасных и часто встречающихся патологий. Тяжелые нарушения водно-электролитного и азотистого обмена являются основными патогенетическими факторами, определяющими высокую летальность при почечной недостаточности [9, 12]. Фармакологическая коррекция этих нарушений остается важнейшей задачей медицины и обусловливает необходимость поиска новых подходов к лечению. Представляет интерес возможность использования для этой цели кровезаменителя перфторана, обладающего газотранспортными, мембраностабилизирующими свойствами, способностью улучшать периферическую микроциркуляцию крови и метаболизм на уровне тканей [5, 6, 8].  Имеются указания о диуретическом свойстве этого препарата [4], а также о его использовании для противоишемической защиты почек при трансплантации [11] и у больных с уросепсисом [3]. Однако ренальные эффекты перфторана и их механизмы исследованы недостаточно.

Цель настоящего исследования – выяснить влияние перфторана на выделительную функцию почек в интактном организме, а также в различные стадии токсического поражения почек в опытах на крысах. 

Методы исследования

Действие перфторана при острой почечной недостаточности (ОПН) исследовано в эксперименте на 50 крысах обоего пола массой 180-250 г, разделенных на 3 группы. Первая группа состояла из интактных животных и служила контролем. После определения фоновых показателей этим крысам вводили перфторан (ОАО НПФ “Перфторан”) в дозе 5 мл на кг массы тела  внутрибрюшинно в течение 3 дней. Вторая группа – животные с глицероловой моделью ОПН. Крысам третьей группы вводили перфторан в дозе 5 мл на кг и через 1 час воспроизводили глицероловую ОПН по методу G. Greven (цит. по [10]). Для моделирования ОПН крыс 2-3 групп выдерживали 24 часа без пищи, после чего внутримышечно вводили 50 % водный раствор глицерола в дозе 10 мл на кг. Затем животных помещали в обменные клетки и собирали мочу в условиях спонтанного диуреза в течение 24 часов. В пробах мочи определяли белок, креатинин, в пробах крови – содержание креатинина. Рассчитывали скорость клубочковой фильтрации (СКФ) и реабсорбцию воды [2]. По отношению объема суточной мочи к количеству выпитой воды оценивали баланс жидкости.

Для выяснения эволюции патологического процесса при глицероловом поражении почек у крыс, в частности, возможности формирования хронической почечной недостаточности (ХПН), была выполнена отдельная серия опытов на 14 животных обоего пола через 2 месяца после введения им глицерола. У этих животных определяли показатели, характеризующие функциональное состояние почек, до и после введения перфторана в дозе 5 мл на  кг  внутрибрюшинно в течение 5 дней.

Поскольку при почечной недостаточности нередко развивается токсическое поражение центральной нервной системы, оценивали интегральный показатель ее состояния – ориентировочную реакцию по тесту “открытого поля” по методу J.R.Boisser, P.Simon [13] в модификации В.С.Балыниной и Березовской И.В. [1] до и после введения перфторана. При этом регистрировали “норковый рефлекс” – количество заглядываний крыс в отверстия стандартной площадки в течение 3 мин.

Полученные данные обрабатывали статистически [7]. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали  критерий t Стьюдента, внутригрупповые различия  (до и после экспериментального воздействия) анализировали по парному критерию Ť Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Результаты и обсуждение

Результаты исследований показали, что у интактных крыс перфторан статистически значимо по критерию Т Вилкоксона (в среднем на 39 %) повышал диурез при неизменной СКФ (табл.1). Следовательно, в здоровом организме механизм диуретического действия обусловлен только торможением канальцевой реабсорбции. Питьевая активность животных уменьшалась на 15% (р<0,05), так что эффективность почечной экскреции выпитой жидкости существенно возрастала. Полученные результаты подтверждают данные [4] о способности пефторана оказывать диуретическое действие.

На модели ОПН опыты выполнены на 2-е сутки, в полиурической стадии. Перфторан, обладающий собственным умеренным мочегонным действием, значительно уменьшал полиурию до 3,8±0,6 мл/100 г против 5,7±1,1 мл/100 г у нелеченных крыс и полидипсию (табл.2). Почечные механизмы действия перфторана обусловлены не только некоторым увеличением СКФ (0,10±0,02 мл/мин с перфтораном  против 0,08±0,01 мл/мин во 2-й группе, в контроле – 0,17±0,02 мл/мин), но и более полной канальцевой реабсорбцией (96,3±0,6 % с перфтораном, при 95,3±0,6 % в группе крыс с моделью ОПН, не получавших препарат). Об эффективности перфторана на модели ОПН свидетельствует и значительное уменьшение уровня креатининемии (в среднем на 31% по сравнению с концентрацией креатинина в крови у нелеченных животных). Показательно также выраженное снижение протеинурии: суточная экскреция белка у крыс с ОПН, получавших перфторан, уменьшилась в среднем на 36% (табл.2).

При двухнедельном наблюдении за крысами с ОПН установлено, что перфторан несколько уменьшает летальность (40 % с перфтораном против 50 % у нелеченных животных).

Опыты, выполненные через 2 месяца после моделирования глицероловой ОПН, показали, что у крыс сформировалось хроническое нарушение выделительной функции почек (табл.3). Об этом свидетельствовали значительное – почти двукратное – снижение СКФ, гиперкреатининемия  (концентрация креатинина превышала показатель интактных животных в среднем в 1,6 раза, р<0,05) и сохраняющаяся протеинурия (суточная экскреция белка превышала контрольное значение более чем в 3 раза, р<0,01).

Как видно из табл.3, после введения  в течение 5 дней перфторана крысам с моделью ХПН значительно возрос диурез (на 42 %, р<0,01),  СКФ возросла до значений, характерных для интактных животных (0,170±0,014 мл/мин), а протеинурия уменьшилась в среднем на 18% (р<0,01).

Оценка состояния центральной нервной системы по ориентировочной реакции показала, что у интактных крыс перфторан в использованной дозе практически не влиял на исследуемый показатель (табл.4). И в острой, и в хронической стадии экспериментальной почечной недостаточности происходило выраженное угнетение активности животных – в 2-3 раза уменьшалось количество обследованных отверстий. На фоне действия перфторана у крыс с моделью ОПН и через 2 месяца после введения глицерола отмечалось статистически значимое улучшение ориентировочной реакции в сравнении с показателями  нелеченных крыс. Это свидетельствует, очевидно, о том, что под влиянием перфторана происходит уменьшение токсических влияний на центральную нервную систему, связанное с улучшением ренальных функций у животных с почечной недостаточностью.

Резюмируя комплекс полученных данных, необходимо отметить, что в интактном организме и у крыс с хронической стадией глицеролового поражения почек перфторан проявляет мочегонное действие, а в условиях ОПН значительно уменьшает полиурическое действие глицерола. В различные стадии модельной патологии перфторан оказывает защитное действие, проявляющееся в улучшении функционального состояния почек, ослаблении нейроинтоксикации и снижении летальности. Несомненно, ценными свойствами перфторана являются нормализация сниженной при поражении почек СКФ и  антипротеинурический эффект, что связано, по-видимому, с уменьшением поражения клубочкового аппарата. В механизме нефропротекторного действия перфторана могут иметь значение его   способность улучшать реологические свойства и микроциркуляцию крови, метаболизм на уровне тканей, а также мембраностабилизирующее действие кровезаменителя.  Представляется перспективным углубленное исследование механизмов благоприятного влияния перфторана при поражении почек различной этиологии.

Таблица 1. Влияние перфторана на функциональное состояние почек у интактных крыс

Показатель

Контроль

(n = 7)

Перфторан

(n = 7)

Значимые различия, р

Диурез,  мл/100 г за сутки

1,00±0,28

1,39±0,3

< 0,05  (Т)

Скорость клубочковой фильтрации, мл/мин

0,12±0,02

0,12±0,02

 

Относительный диурез, %

10,5±2,1

17,4±1,9

<  0,01

Потребление воды, мл/100 г за сутки

9,3±1,2

7,9±1,0

< 0,05  (Т)

Суточная экскреция белка, мг/100 г

0,19±0,02

0,19±0,02

 

Экскреция креатинина, мкмоль/100 г

11,1±1,52

11,7±1,67

 

Креатинин крови,  мкмоль/л

72,9±4.3

73,2±3,6

 


Таблица  2. Влияние перфторана на показатели функционального состояния почек при глицероловой модели ОПН у крыс

Показатель

Контроль

(n = 20)

ОПН

(n = 16)

ОПН+

Перфторан
(n =14)

Значимые различия, р

Выживаемость, %

100

50

60

 

Суточный диурез,  мл/100 г

1,7±0,3

5,7±1,1*

3,8±0,6

 

Скорость клубочковой фильтрации, мл/мин

0,17±0,02

0,08±0,01*

0,10±0,02

 

Реабсобция воды, %

98,5±0,3

95,3±0,6*

96,3±0,6

 

Относительный диурез, %

16,6±2,2

34,9±3,5*

30,1±4,5

  

Питьевая активность,  мл/100 г

10,1±0,8

14,8±1,3*

12,5±0,7

  

Суточная экскреция белка, мг/100г

0,14±0,02

1,19±0,08*

0,76±0,09

  < 0,05

Экскреция креатинина, мкмоль/100 г

11,1±1,7

32,5±4,2*

19,8±3,2

   < 0,05

Креатинин крови, мкмоль/л

72,9±4,3

286,0±20,0*

197,0±22,0

   < 0,01

Примечание. Звездочка – значимые различия с контролем (p<0,05);

р – статистически значимые различия между крысами с моделью ОПН, получавшими и не получавшими перфторан.

Таблица 3. Ренальные эффекты перфторана у крыс с моделью хронической почечной недостаточности

Показатель

Контроль

 (n =20)

ХПН

(n = 16)

ХПН + перфторан

(n = 14)

р

Суточный диурез,  мл/100 г

1,70±0,32

1,96±0,26

2,79±0,33

< 0,01

Скорость клубочковой фильтрации,  мл/мин

0,17±0,02

0,09±0,003 *

0,17±0,02

< 0,01

Реабсобция воды, %

98,5±0,3

98,1±0,2

98,2±0,3

 

Относительный   диурез,  %

16,6±2,2

21,4±2,3

41,0±5,7

< 0,01

Суточное потребление воды, мл/100 г

10,1±0,8

9,6±0,9

9,1±1,4

 

Протеинурия,  мг/100г

0,15± 0,02

0,48±0,02*

0,39±0,03

< 0,01

Экскреция креатинина, мкмоль/100 г

11,1±1,7

24,3±2,6 *

22,8±2,5

< 0,05

Концентрация креати- нина в крови, мкмоль/л

72,3±4,3

116,0±9,0 *

118,0±10,0

 

Примечание. Звездочка – статистически значимые различия  по сравнению с контролем по  t-критерию Стьюдента (p<0,05); р – статистически значимые различия между показателями крыс с моделью ХПН до и после введения перфторана по критерию Вилкоксона

Таблица 4. Влияние перфторана на ориентировочную реакцию крыс

Условия эксперимента

Количество отверстий,
обследованных за 3 мин

р

 Интактные крысы:

 – контроль (n = 9)

 – перфторан  (n = 9)

17,0±1,3

16,5±1,6

 

 

 ОПН  (n = 9)

 ОПН + перфторан  (n = 9)

6,0±1,1

11,0±1,6

< 0,01*

< 0,05 **

 ХПН  (n = 8)

 ХПН + перфторан  (n = 9)

8,0±1,1

14,0±1,4

< 0,01*

< 0,01**

Примечание. Одна звездочка – значимые различия с контрольным показателем интактных крыс, две звездочки – с показателем нелеченных крыс с моделью почечной недостаточности.


  Литература

  1. Балынина В.С., Березовская И.В. Сравнительная оценка методов определения ориентировочной реакции крыс в токсикологическом эксперименте // Фармакол. и токсикол. – 1976. – № 5. – с.63-67.
  2. Берхин Е.Б., Иванов Ю.И. Методы экспериментального исследования почек и водно-солевого обмена. – Барнаул: Алтайское книжн. из-во, 1972.- 199 с.
  3. Гармиш О.С., Забашный С.И., Овчинникова Л.Ю. и др. Перфторан в комплексе терапии уросепсиса // VII Всерос. съезд анестезиологов и реаниматологов 25-27 сент. 2000 г.: Тез. докл. / Под ред. Ю.С. Полушина.- СПб.: ВМедА, 2000. – с.53-54.
  4. Иваницкий Г.Р. Биофизические основы создания перфторуглеродных сред и газотранспортных кровезаменителей (обзор) // Перфторорганические соединения в биологии и медицине: Сб. науч. тр. / Под ред. Г.Р. Иваницкого, В.В. Мороза. – Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2001.– с.4-48.
  5. Иваницкий Г.Р., Воробьев С.И. Кровезаменитель “Перфторан” // Вестн. РАН. – 1997. – Т.67, № 11. – с.998-1008.
  6. Иваницкий Г.Р., Воробьев С.И., Мороз В.В. Газотранспортная эмульсия – перфторуглеродный заменитель “Перфторан”: состав, свойства и механизм действия // Реаниматология на рубеже ХХI века: Материалы Междунар. симп., посв. 60-летию НИИ общей реаниматтологии РАМН, Москва, 2-4 дек. 1996. – М.: Б.и., 1996. – с.282-283.
  7. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. Обработка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах. – М.: Медицина, 1990. – 224 с.
  8. Мороз В.В., Крылов Н.Л., Иваницкий Г.Р. и др. Применение перфторана в клинике // Анестезиология и реаниматология. – 1995. – № 6. – с.12-17.
  9. Нечаев Э.А., Раевский А.К., Савицкий Г.Г. Синдром длительного сдавливания. – М.: Медицина, 1993. – 208 с.
  10. Носкова А.П. Влияние фуросемида и маннитола на выживаемость крыс при острой почечной недостаточности // Фармакологическая регуляция функции почек / под ред.А.А.Лебедева.- Куйбышев, 1981.- с.40-44.
  11. Тарабаренко Н.В., Онищенко Н.А., Балкаров А.Г. и др. Использование перфторана в
  12. Тарабаренко Н.В., Онищенко Н.А., Балкаров А.Г. и др. Использование перфторана в реперфузионном периоде для профилактики острой недостаточности почечного трансплантанта // Перфторорганические соединения в биологии и медицине: Сб. науч. тр. / Под ред. Г.Р. Иваницкого, В.В. Мороза. – Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2001.– с.146-151.
  13. Шулутко Б.И. Болезни печени и почек. – СПб.: РЕНКОР, 1995. – 480 с.
  14. Boisser J.R., Simon P. L’utilisation d’une reaction, particuller de souris (methode de la pache a trous) pour l’etude des medicaments psychotropes // J. Therapie. – 1964. – vol.19, № 3. – p.571-578.