Влияние перфторорганических соединений на роcт и развитие бактерий и микромицетов


М.К. Бакулин, И.В. Дармов, Е.В. Чеботарев, А.С. Кучеренко, Л.В. Бакулина, Н.А. Кривошеина

Вятский гоcударственный университет, Киров


Разработка и поcледующее внедрение в практику современных технологий культивирования бактерий и микромицетов, получения микробной биомассы и биологически активных веществ-продуктов жизнедеятельноcти микроорганизмов имеет большое практическое значение. С их помощью в наши дни получают разнообразные продукты питания, белковые препараты, аминокислоты, органические кислоты, спирты, физиологически активные вещества – антибиотики, ферменты, гормоны, стимуляторы роcта, вакцины против инфекционных заболеваний человека и животных, эубиотики, биодеструкторы разнообразных антропогенных загрязнений окружающей среды, средства борьбы с насекомыми и грызунами – вредителями сельского хозяйства.

Для обеспечения высокого энергетического обмена большинству микроорганизмов, используемых человеком в биотехнологии, для роcта, развития и продукции биологически активных веществ жизненно необходим кислород [1]. Он является важнейшим элементом, используемым микроорганизмами для поcтроения структурных компонентов микробной клетки, получения энергии и непоcредственно участвует в различных биохимических реакциях, обеспечивающих процессы жизнедеятельноcти микробов.

Обеспечение кислородом или его удаление для анаэробов, как и удаление отработанных газов и продуктов метаболизма, является одним из важнейших факторов эффективноcти биотехнологических процессов, определяющих продуктивноcть накопления их биомассы и синтеза биологически активных веществ.

Низкая растворимоcть кислорода в культуральной среде при выращивании микроорганизмов, соcтавляющая всего несколько граммов O2 на м3, не обеспечивает большеобъемный биоcинтез в необходимой степени. Потребноcть микроорганизмов в кислороде может соcтавлять десятки килограммов O2 на кубический метр культуральной среды в час [2].

Целью настоящей работы являлась экспериментальная оценка перспектив использования перфторорганических соединений с газотранспортной функцией в биотехнологии для совершенствования процессов глубинного культивирования практически полезных микроорганизмов.

С учетом этого нами было исследовано влияние на роcт бактерий и микроcкопических грибов (микромицетов) внесения в культуральные среды разных концентраций перфтордекалина или коммерческого препарата «Перфторан» [3, 4].

Из бактериальных культур нами были использованы штаммы Rhodococcus erythropolis ВУ 5 и ВУ 43, Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 81 и ВБМ 158, Escherichia coli M 17, Pseudomonas putida ПП 44, Bacillus subtilis 3; из микромицетов были использованы штаммы Penicillium chrysogenum МВ 104, Fusarium moniliforme ВУ 245, Fusarium graminearum 534, Saccharomyces cerevisiae К. Культуры указанных микроорганизмов были выбраны, потому что в биотехнологии при производстве практически полезных продуктов используется большое количество штаммов этих видов для получения дорогоcтоящих антибиотиков, эубиотиков, микопротеина, пищевых продуктов, стимуляторов роcта растений – гиббереллинов. Псевдомонады и родококки используются в качестве биодеструкторов ксенобиотиков.

Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 и ВБМ 81 - штаммы бактерий актиномицетов. Продуценты антибиотика рубомицина, обладают типичными культурально-морфологическими и тинкториальными свойствами, аэробы. Воздушный мицелий развит. Имеются оcобые воздушные гифы (спорофоры) и мицелий, прорастающий в толщу питательной среды. При микроcкопии в мазках, окрашенных по Граму, бактериальные клетки имеют вид тонких длинных ветвящихся нитей, окрашенных грамположительно. На плотной питательной среде колонии красновато-малинового цвета. Колонии имеют неровные края шероховатую поверхноcть с кратерообразным вдавлением в центре. В процессе выращивания на ППС колонии выделяют пигменты, окрашивающие агар соответственно в малиновый цвет в кислой среде и в фиолетовый в щелочной. Оптимальная температура роcта (28-30)оС.

Bacillus subtilis 3 – штамм сенной палочки, культура используется в качестве эубиотика для лечения желудочно-кишечных расстройств у людей. При микроcкопии отмечаются грамположительные палочки с закругленными концами; расположены одиночно, парами или цепочками. Факультативный анаэроб. Разжижает желатину, гидролизует крахмал, казеин, ферментирует глюкозу и мальтозу. Хорошо размножается на пртых питательных средах. На поверхности агара через сутки клоны образуют белесоватые круглые выпуклые колонии с ровными краями.

Escherichia coli M 17 - штамм кишечной палочки, культура используется в качестве эубиотика для лечения желудочно-кишечных расстройств у людей. При микроскопии агаровой культуры данного штамма отмечаются прямые одиночные и парные грамотрицательные палочки. Факультативный анаэроб, оптимум роста отмечается при температуре 35-37оС, хорошо размножается при комнатной температуре на обычных средах. На плотной среде образуют слабовыпуклых полупрозрачных сероватые колонии, в бульоне вызывает диффузное помутнение с образованием осадка.

Rhodococcus erythropolis ВУ 5 и ВУ 43 – штаммы широко распространенных почвенных бактерий, выделены из почвы в Кировской области. При микроскопии окрашенных по Граму мазков отмечаются не образующие спор грамположительные округленные короткие палочковидные и овальные бактерии, при разделении располагаются под углом друг к другу. Клетки в препаратах «раздавленная» и «висячая» капля неподвижные. Оптимальная температура роста (28-32)оС. Аэробы. При росте на плотной среде образуют круглые, выпуклые с ровным краем блестящие слизистые колонии бледно-бежевого цвета.

Pseudomonas putida ПП 44 и ПП 35 - штаммы широко распространенных почвенных бактерий, обладающие типичными характеристиками псевдоманад. Культуры выделены из почвы. При микроскопии окрашенных по Граму мазков отмечаются не образующие спор грамотрицательные палочковидные бактерии с полярно расположенными жгутиками. Бактерии этого вида способны окислять необычайно большое число различных органических соединений, энергию получают путем аэробного дыхания (строгие аэробы), хемоорганотрофы. На плотной среде образуют круглые выпуклые белесоватые с кремовым оттенком колонии с ровным краем. Оптимальная температура роста (28-30)оС.

Penicillium chrysogenum МВ 104 – культура штамма микромицета, выделенного из садовой почвы, обладает типичными для пеницилл культурально-морфологическими и тинкториальными видовыми свойствами, энергию получает путем аэробного дыхания. Морфологически представляет кистевидную плесень, конидиеносец со стеригмами имеет вид кисточки, на концах стеригм цепочки конидий. На агаре Чапека формирует колонии до 30 – 34 мм в диаметре, складчатые, бархатистые, край белый, конидиальная зона зеленая, реверзум лимонного цвета. Оптимальная температура роста (28-30)оС.

Fusarium moniliforme ВУ 245 - микромицет, штамм выделен из кукурузы, обладает типичными культурально-морфологическими и тинкториальными видовыми свойствами, энергию получает путем аэробного дыхания. Макроконидии в воздушном мицелии веретено-серповидные, эллиптически изогнутые, с постепенно суживающейся, несколько удлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой у основания, имеют пять перегородок, микроконидии овальные. На среде Чапека колонии до 34 – 38 мм в диаметре, складчатые, бархатистые, воздушный мицелий бело-розовый, строма розовая. Температура роста (25-28)оС.

Fusarium graminearum 534 - микромицет, штамм выделен из зерновки пшеницы и обладает типичными культурально-морфологическими и тинкториальными видовыми свойствами. Макроконидии в воздушном мицелии веретено-серповидные, эллиптически изогнутые, с постепенно суживающейся, несколько удлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой у основания, имеют три перегородки. На среде Чапека колонии до 32 – 36 мм в диаметре, складчатые, бархатистые, воздушный мицелий бело-розовый, строма кремовая. Температура роста (25-28)оС.

Saccharomyces cerevisiae К – штамм пекарских дрожжей, обладающий типичными культурально-морфологическими и тинкториальными видовыми свойствами, выделен в виде чистой культуры для лабораторных исследований из прессованных дрожжей кировского хлебозавода. При микроскопии отмечаются однородные по морфологии овальные отдельные клетки размером 5-9 мкм, обладающие толстой клеточной стенкой и типичной для эукариот структурой. Культура дрожжей S. cerevisiae 5 сбраживает глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, раффинозу. Хорошо растет на среде Сабуро, Чапека-Докса, агаре Чапека. Факультативный анаэроб. Оптимальная температура роста (28-30)оС.

Для выращивания бактерий и микромицетов использовали мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар и стандартные среды: агар Чапека, среду Чапека-Докса, приготовленные по рекомендованным прописям и технологии [5]. Для выращивания стрептомицетов и фузариозных грибов использовали жидкую питательную среду с соевой мукой, содержащую крахмал - 3,0%; соевую муку - 3,0%; (NH4)2С4Н4О6 - 0,5%; (NH4)2SO4 - 0,4%; CaCO3 - 0,8%; K2HPO4 - 0,01%; глюкозы - 1,5% (вводится в стерильную питательную среду); воды водопроводной до 100%.

В задачу наших исследований входила оценка влияния внесения в среду культивирования пефтордекалина или субмикронной эмульсии «Перфторан» на скорость роста и развития микроорганизмов и прирост биомассы при глубинном культивировании [6, 7]. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 см3 с 80 см3 жидкой питательной среды, содержащей посевные культуры, соответствующего штамма (до конечной концентрации биомассы или концентрации клеток бактерий указанных в табл. 1 – 4 на 0 часов культивирования), и от 0,2 до 25 % перфторана или 0,2 и 2,0 % (по объему) перфтордекалина. Выращивание проводили при (28±2)°С и постоянном шуттелировании со скоростью вращения 230 оборотов в минуту. За ростом актиномицетов наблюдали в течение 11 суток (табл. 1). Через каждые 24 часа отбирали пробы по 5 мл и определяли сухую массу стрептомицетов (в мг%). Контролем во всех экспериментах служили культуры в колбах со средой, отличающейся от опытных сред только отсутствием ПФОС.

Результаты экспериментов, представленные в табл. 1, свидетельствуют, что содержание биомассы стрептомицетов при росте на ферментационной среде на основе соевой муки с добавлением 5% перфторана уже через 72 часа роста по абсолютной величине превышал максимальный прирост биомассы тех же культур, достигаемый на 168 час роста на среде без перфторана, а максимальное содержание биомассы в первой среде для штамма S. purpurogeniscleroticus ВБМ 158, достигаемое на 120 час роста, составляющее 1848 мг%, в 3,7 раза превышало максимальную концентрацию на среде без перфторана.

Таблица 1. Изменение биомассы Streptomyces purpurogeniscleroticus при росте в среде на основе соевой муки с добавлением перфторана

Штамм Streptomyces purpurogeniscle-roticus Содержание в среде перфторана, % Биомасса актиномицетов (мг %) в среде в процессе роста через … ч от начала культивирования
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264
ВБМ - 158 0 45 58 154 295 374 398 457 494 441 436 460 387
0,2 45 63 168 346 408 478 583 649 582 577 528 521
1 45 69 184 385 451 857 651 673 589 546 509 502
5 45 95 350 692 1248 1848 1539 1470 1305 1378 1335 1196
25 45 96 348 484 743 796 704 663 650 539 492 429
ВБМ - 81 0 51 56 142 258 310 342 432 457 438 409 391 365
0,2 51 62 154 307 398 458 503 543 538 530 521 452
1 51 71 177 364 449 619 704 762 693 680 643 563
5 51 90 324 645 1016 1316 1250 1150 1028 954 832 708
25 51 92 343 496 895 835 796 745 712 628 621 524


Примечание. С целью большей наглядности результатов мы сочли целесообразным в настоящей таблице и в таблицах 2-6 привести только средние арифметические результаты по 4-6 определениям содержания биомассы и концентраций живых бактерий. Во всех случаях степень отклонения единичного определения от средней арифметической не превышала 15%.



Выращивание культур штаммов Pseudomonas putida и Rhodococcus erythropolis проводили в течение 48 часов при (28±2)°С на жидкой питательной среде, на основе соевой муки с добавлением перфторана. Пробы отбирали через каждые 8 часов по 2 мл для определения количества живых клеток псевдомонад и родококков в культуральной среде методом высева серийных разведений на плотную питательную среду на основе МПА (табл.2 и 3).

Таблица 2. Рост культуры бактерий Pseudomonas putida на жидкой питательной среде, на основе соевой муки с добавлением перфторана

Штамм P. putida Содержание в среде перфторана, % Количество живых бактерий/см3 через … ч от начала культивирования, (*106)
0 8 16 24 32 40 48
ПП 44 0 48 68 348 2239 6594 6703 6221
0,2 48 75 490 4563 7041 7094 5342
1 48 104 935 6563 8472 8374 7125
5 48 178 3789 28258 27533 18500 14054
25 48 112 3645 12763 9804 7071 5285
ПП 35 0 64 75 387 1338 6503 8702 7669
0,2 64 86 612 2313 9044 9453 7348
1 64 112 1158 5431 11348 10986 8545
5 64 174 5982 12995 12502 10438 7659
25 64 132 3624 7825 7024 6351 4300


Результаты экспериментов, представленные в табл. 2 и 3, свидетельствуют, что при росте на ферментационной среде на основе соевой муки с добавлением 5% перфторана максимальное содержание живых бактерий псевдомонад и родококков достигаемое уже через 24 часа роста по абсолютной величине превышало в 1,5 – 4,2 раза максимальный прирост биомассы тех же культур, зафиксированный на 40 час роста на среде без перфторана. Увеличение содержания перфторана в среде до 25% приводило к снижению достигаемых прироста биомассы S. purpurogeniscleroticus и концентраций клеток P. putida и R. erythropolis в сравнении с аналогичными показателями для среды с 5% перфторана. Аналогичные результаты были получены при росте бактерий на МПБ с перфтордекалином (табл.4). При росте культур бактерий P. putida, R. erythropolis, E. coli и B. subtilis на мясо-пептонном бульоне с добавлением 2% перфтордекалина, уже через 24 часа культивирования было отмечено, максимальное содержание количества живых бактерий в среде, которое в 1,3 – 1,7 раз превышало максимум концентраций живых клеток, достигнутый в среде без перфторана только через 36 часов культивирования.

Следует также отметить, что даже добавление 0,2% перфтордекалина в среду культивирования приводило к ускорению роста исследуемых бактерий в сравнении с контролем, что особенно отчетливо отмечается при выращивании P. putida.

Таблица 3. Рост культуры бактерий Rhodococcus erythropolis на жидкой питательной среде, на основе соевой муки с добавлением перфторана

Штамм R. erythro-polis Содержание в среде перфторана, % Количество живых бактерий/см3 через … ч от начала культивирования, (*106)
0 8 16 24 32 40 48
ВУ 5 0 24 26 258 1485 2110 2386 2105
0,2 24 43 397 1981 2304 2395 2024
1 24 68 548 4068 3706 2974 2748
5 24 113 1569 6783 4378 4307 4032
25 24 67 1406 5434 3132 2985 2210
ВУ 43 0 35 43 198 2632 3045 2945 2368
0,2 35 51 345 3268 3286 3587 3152
1 35 73 754 3670 3670 3670 3670
5 35 124 2054 9450 7541 7105 5793
25 35 107 1526 8408 6752 5054 3421




Таблица 4. Рост культур бактерий Pseudomonas putida, Rhodococcus erythropolis, Escherichia coli и Bacillus subtilis на мясо-пептонном бульоне с добавлением перфтордекалина

Штамм Содержание в среде перфтордекалина, % Содержание в среде перфтордекалина, %
0 12 24 36 48
P. putida ПП 44 0 49 96 1899 5029 4342
0,2 49 163 6986 5732 4437
2,0 49 251 8475 6348 4903
R. erythropolis ВУ 43 0 42 77 1087 2438 2298
0,2 42 85 1584 2953 2568
2,0 42 97 3948 3732 2329
E. coli M 17 0 45 109 2436 6423 5563
0,2 45 112 2662 7484 5431
2,0 45 125 8425 6617 5042
B. subtilis 3 0 54 74 985 2261 2138
0,2 54 77 1112 2532 2315
2,0 54 80 2933 2397 2254


На следующем этапе исследований была оценена возможность многократной стерилизации перфтордекалина автоклавированием. В ходе предварительных экспериментов было показано, что однократная стерилизация перфтордекалина при избыточном давлении от 0,5 до 2,0 ати, что соответствовало температурному воздействию 111°С до 134°С с экспозицией – 30 - 90 мин существенно не влияла на его эксплуатационные свойства.

Важным результатом проведенных исследований явилось то, что была показана возможность многократного использования перфтордекалина. С этой целью после каждого цикла культивирования бактерий Pseudomonas putida P. putida ПП 35 и E. coli M 17на МПБ с добавлением 10 % перфтордекалина, последний извлекали из среды, подвергали автоклавированию в течение 60 мин при 1,0 ати и повторно использовали для выращивания новой культуры в описанных выше условиях (табл. 5).

Таблица 5. Результаты оценки возможности многократного использования перфтордекалина в жидкой питательной среде (МПБ) для культивирования микроорганизмов

Штаммы бактерий (количество циклов культивирования)

Концентрация клеток (´107) живых бактерий после выращивания в течение 24 часов в МПБ с 10 % перфтордекалина, использованного и стерилизованного …

контроль

 

однократно

 

двукратно

 

 

трехкратно

 

четырехкратно

 

пятикратно

 

P. putida ПП35

 

(пять циклов)1

 

 

174

 

862

 

847

 

856

 

864

 

860

 

E. coli M 17

(пять циклов)

 

244

 

811

 

804

 

797

 

808

 

814

 

E. coli M 17 (2 цикла)/
P. putida ПП 35 (3 цикла)2

 

 

242/175

 

815

 

803

 

858

 

869

 

867

 



Примечания:

1. Использовали перфтордекалин при последовательном выращивании культуры одного штамма; 2. Последовательно использовали перфтордекалин при культивировании E. coli M 17 (2 цикла), P. putida ПП 35 (3 цикла), после каждого цикла отбирали его из культуральной жидкости проводили стерилизацию и использовали его в составе МПБ в следующем цикле культивирования. Контрольные культуры выращивали без применения перфтордекалина. В контроле последовательно выращиваемых культур указаны концентрации клеток, достигаемые на конец культивирования для обеих культур.

Проведенные на псевдомонадах и эшерихиях исследования показали возможность многократного (не менее пяти раз) использования перфтордекалина после извлечения его из культуральной среды и автоклавирования. При этом потери его в каждом цикле культивирования – стерилизации в условиях наших экспериментов не превышали 10%. Более того, результаты экспериментов на примере E. coli M 17 (2 цикла), P. putida ПП 35 (3 цикла) свидетельствовали, что повторное использование перфтордекалина без изменения его активности возможно даже при смене культивируемых микроорганизмов. Практический интерес представляют результаты по выращиванию микромицетов родов Penicillium, Fusarium и Saccharomyces в жидкой питательной среде Чапека-Докса в присутствии перфтордекалина.

В колбы Эрленмейера объемом 250 см3 предварительно вносили посевные культуры соответствующего штамма (до конечной концентрации биомассы указанной на 0 часов культивирования в табл. 6) и перфтордекалин из расчета конечной концентрации 2%, а затем доводили жидкой питательной средой Чапека-Докса общий объем рабочей смеси до 70 см3. Культивирование продолжали в течение 10 суток, каждые 48 часов отбирали пробы по 5 мл для определения биомассы.

Результаты экспериментов представленные в табл. 6 свидетельствуют, что при росте культур микромицетов P. chrysogenum МВ 104, F. moniliforme ВУ 245, F. graminearum 534, S. cerevisiae К на среде Чапека – Докса с добавлением 2% перфтордекалина уже через 48 - 96 часов культивирования было отмечено максимальное содержание количества биомассы, при этом пик концентрации биомассы на среде без перфтордекалина был получен во всех случаях на 48 часов позже. При этом максимальные значения биомассы на среде с перфтордекалином в 1,3 раза (для дрожжей), в 2,0-2,5 раза (для пеницилл и фузариев) превышали максимумы, достигаемые на среде без перфтордекалина.

Таблица 6. Изменение биомассы микромицетов при культивировании в среде Чапека – Докса с добавлением перфтордекалина

Штамм

 

Содержание в среде перфтордекалина, %

 

Биомасса микромицетов (мг %) в среде Чапека – Докса в процессе роста через … ч от начала культивирования

 

0

 

 

48

 

 

96

 

 

144

 

 

192

 

 

240

 

 

P. chrysogenum МВ104

 

 

0

 

 

36

 

 

259

 

 

705

 

 

816

 

 

794

 

 

745

 

 

2,0

 

 

36

 

 

682

 

 

1656

 

 

1518

 

 

1356

 

 

880

 

 

F. moniliforme ВУ245

 

 

0

 

 

48

 

 

272

 

 

764

 

 

858

 

 

803

 

 

731

 

 

2,0

 

 

48

 

 

743

 

 

2145

 

 

1652

 

 

1493

 

 

976

 

 

F. graminearum 534

 

 

0

 

 

42

 

 

264

 

 

687

 

 

795

 

 

783

 

 

645

 

 

2,0

 

 

42

 

 

729

 

 

1964

 

 

1421

 

 

1245

 

 

927

 

 

S. cerevisiae К

 

 

0

 

65

 

440

 

497

 

220

 

204

 

134

 

2,0

 

65

 

632

 

518

 

321

 

242

 

128

 



Содержание биомассы P. chrysogenum МВ 104 при культивировании в среде Чапека – Докса с добавлением перфтордекалина



Содержание биомассы F. moniliforme ВУ 245 при культивировании в среде Чапека – Докса с добавлением перфтордекалина




Подводя итог проделанной работе можно однозначно отметить, что внесение перфтордекалина или перфторана в глубинную культуру приводит к интенсификации ее массообменных характеристик, что подтверждается повышением скорости роста и увеличением выхода биомассы или абсолютных количеств микроорганизмов. При этом затраты на использование ПФОС при глубинном культивировании бактерий и микромицетов, в большинстве случаев будут рентабельны за счет более высокого выхода целевых продуктов.

Литература

1. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Материалы 1-го Международного Конгресса. Москва, 14-18 октября 2002 г. – М.:ЗАО Максима», РХТУ им Д. И. Менделеева, 2002. – 544 с.

2. Промышленная микробиология/Под ред. Н. С. Егорова. – М.: Высшая школа, 1989. – 688 с.

3. Иваницкий Г. Р. Биофизические основы создания перфторуглеродных сред и газотранспортных кровезаменителей (обзор) //Сборник научных трудов НПФ «Перфторан»: Перфторорганические соединения в биологии и медицине. - Пущино: ПНЦ РАН, 2001. Вып. XI. - С. 4-48.

4. Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине / Под ред. Г. А. Сафронова Тез. науч. конф. 19-20 июня 2001 г. Санкт-Петербург: ВМА, 2001. - 129 с.

5. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. – М.: Медицина, 1978. – 392 с.

6. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Кривошеина Н. А. и др. Оптимизация биотехнологического процесса выращивания – актиномицетов с использованием перфторуглеродов//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. «Наука-производство-технологии-экология», Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.№3. С. 90-91.

7. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Золотарев А. Г., Кривошеина Н. А. Нужна ли «голубая кровь микроорганизмам»?// МВФ. Медицина. Фармация, 2003, № 2. – С. 7-11.

Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Бакулина Л. В. и др. Биологическая безопасность использования перфторорганических соединений в биотехнологии//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. «Наука-производство-технологии-экология», Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.№3. С. 84-85.