Использование перфторуглеродов для интенсификации процессов микробной деградации ксенобиотиков на примере нефти и нефтепродуктов


М.К. Бакулин, Е. В. Чеботарев, А. С. Кучеренко

Вятский государственный университет, Киров


Нефть относится к наиболее интенсивно используемым природным полезным ископаемым. Процессы добычи, транспортировки, переработки нефти и использования нефтепродуктов часто сопровождаются технологическими и аварийными выбросами их во внешнюю среду, что приводит к загрязнению и нарушению экосистем различной интенсивности, вплоть до экологических катастроф. Площади нефтезагрязненных земель и водоемов с каждым годом увеличиваются, поэтому продолжает оставаться актуальной проблема разработки новых и совершенствования существующих технологий ликвидации последствий техногенных контаминаций нефтью и нефтепродуктами и восстановления биопотенциала нарушенных экосистем [1].

Экономический эффект, получаемый в результате реабилитации природного потенциала при очистке от нефтяных загрязнений одного гектара земли, изымающейся из пользования в результате аварийных выбросов нефтепродуктов, составляет несколько десятков тысяч долларов (в зависимости от структуры землепользования, для пахотных земель – 30000 долларов, для пастбищных и сенокосов – 200000 долларов, для промышленных районов – 2335000 долларов) [2].

В последние годы появилось много публикаций об эффективном использовании микроорганизмов для удаления экотоксикантов на основе нефти [2 - 4]. Механизмы микробной биодеструкции нефти и нефтепродуктов самые разнообразные: от биотрансформации под воздействием разнообразных ферментов, до полной утилизации и использования в качестве источника углерода и энергии. С учетом таких способностей микроорганизмов был предложен метод биокоррекции загрязнений, который включает в качестве основных подходов биостимуляцию – активацию деградирующей способности аборигенной микрофлоры почвы или воды, путем внесения биогенных элементов, и биодополнение – интродукцию в загрязненные нефтепродуктами очаги специализированных микроорганизмов.

Основные преимущества микробиологической деструкции перед другими методами заключаются: в более полной степени очистки, экологической безопасности, относительной дешевизне, возможности постоянной обработки “хронических” загрязнений и возможности использования в зонах труднодоступных для выемки грунтов.

Еще недавно предполагалось, что микроорганизмы, способные разлагать и использовать углеводороды нефти и нефтепродуктов, встречаются только там, где расположены нефтепромыслы, нефтехранилища или нефтепроводы, т. е. только там, где имеются источники постоянного загрязнения ими внешней среды. Однако, согласно современным данным, такие микроорганизмы распространены очень широко и могут быть выделены из любой луговой, лесной, полевой почвы [2-4]. Кроме того, способность использовать нефть в качестве источника энергии присуща не только конкретным специализированным формам микробов, а широкому кругу бактерий и микроскопических грибов.

К биодеструкторам нефтепродуктов относят значительное число микроорганизмов представителей разных таксономических групп: псевдомонад, бацилл, родококков, микобактерий, дрожжевых микромицетов и других микробов. Всем этим микроорганизмам при росте на углеводородах нефтепродуктов крайне необходим кислород.

Предельные скорости транспорта кислорода в средах, содержащих высокие концентрации углеводородов, часто остаются недостаточными в отношении микроорганизмов нефтедеструкторов, что существенно ограничивает скорость и степень биодеградации нефти и нефтепродуктов. С учетом этого нами было использовано внесение в среды разных концентраций перфторорганического соединения (ПФОС) с газотранспортной функцией – перфтордекалина. При этом ПФОС нас заинтересовали из-за своей химической устойчивости и большой способности растворять газы. Известно, что они растворяют до 40-50 об. % кислорода и до 150-200 об. % углекислого газа и способны доставлять их клеткам и тканям организма [5].

Цель данной работы заключалась в экспериментальном обосновании перспективности использования перфторорганических соединений с газотранспортной функцией для ускорения процессов биодеградации нефти и выращивания микроорганизмов биодеструкторов на синтетических средах содержащих только воду, соли, а в качестве источника углерода и энергии нефть или нефтепродукты, что позволяет адаптировать биодеструкторы для интродукции в места нефтезагрязнений.

В качестве биодеструкторов нефтепродуктов были использованы выделенные сотрудниками лаборатории микробиологии ВятГУ культуры углеводородокисляющих бактерий родов Pseudomonas, Rodococcus и Bacillus [6]. Характеристика основных культурально-морфологических свойств использованных штаммов представлена в табл. 1.

Таблица 1.Свойства штаммов бактерий биодеструкторов

Штамм

Характеристика клеток

Характеристика колоний

Отношение к кислороду

Форма

окраска по Граму

Подвиж­ность

форма

цвет

Pseudomonas putida

ВУ186

Палочки с закругленными концами

Г-

Подвижны

Круглые, выпуклые, край ровный

Светло- серый или кремовый

Аэробы

Rhodococcus erythropolis

ВУ 321

Палочковид­ные, закруглен­ные концы

Г+

Неподвижны

Круглые, выпуклые, край ровный

Бледно-бежевые

Аэробы

Bacillus

subtilis

ВУ 367

Палочки с  закругленными концами

Г+

Подвижны

Круглые, выпуклые, край ровный

Белые или светло серые

Факульта­тивные анаэробы



Для выращивания углеводородокисляющих микроорганизмов, использовали синтетическую минеральную среду следующего состава (г/л): аммоний фосфорнокислый однозамещенный – 9,0; натрий фосфорнокислый однозамещенный – 1,0; калий фосфорнокислый двузамещенный – 10,0; кальция хлорид – 0,04; магний сернокислый семиводный – 0,7; железо сернокислое семиводное – 0,013; цинк сернокислый семиводный – 0,012; марганец сернокислый семиводный – 0,012; воды водопроводной до 1 дм3, рН среды 6,9±0,1. Навески солей растворяли в воде раздельно и смешивали после стерилизации в асептических условиях, затем доводили рН среды до заданных значений.

В стерильные колбы Эрленмейера емкостью 250 см3 вносили: навески 0,5 г (1 % по массе) нефти или мазута; 0,5 или 2,5 см3 перфтордекалина (1 и 5,0 об.%); культуру одного из микроорганизмов биодеструкторов в объеме 1 см3 с концентрацией 5.109 бактерий/см3 по оптическому стандарту мутности (ОК), а затем готовой синтетической средой доводили общий объем рабочей смеси до 50 см3 (до конечной концентрации в рабочей суспензии 1.108 живых бактерий в 1 см3 по ОК). Одновременно ставили контрольные опыты с колбами, в которых отсутствовал один из исследуемых компонентов: нефтепродукт, культура микроорганизмов или перфтордекалин, а также определяли биологическую концентрацию (количество живых) бактерий в среде путем высева серийных разведений культуры на плотную среду на основе мясопептонного агара.

Колбы помещали на шуттель, выращивание культур вели в течение 4 суток при (29±2)°С и 250 оборотах в минуту. Для сравнения характера роста бактерий при нормальном углеводном питании с культурой Pseudomonas putida ВУ186 был поставлен эксперимент, когда в жидкую синтетическую среду вместо нефтепродуктов добавили стерильный раствор глюкозы до конечного содержания ее в среде 0,5 г (1%).

Количественное определение нефтепродуктов в среде после культивирования проводили гравиметрическим (весовым) методом. Метод достаточно прост, не требует сложного дорогостоящего оборудования. Недостатком метода считается относительно большая погрешность при обнаружении легких фракций углеводородов. Для преодоления этого недостатка, в схему анализа была включена контрольная проба, представляющая собой смесь питательной среды с эквивалентным количеством нефтепродукта и проводимая по режиму опытных проб, но без добавления микробного инокулята. Во время выращивания каждые 24 часа и после окончания процесса отбирали пробы объемом 0,2 мл для определения количества живых бактерий методом серийных разведений с высевом на плотную питательную среду на основе мясопептонного агара.

После завершения процесса выращивания с помощью делительной воронки извлекали перфтордекалин и проводили экстракцию остатков нефтепродуктов хлороформом (25 см3 на весь объем среды) на шуттеле в течение 20 минут и последующей 8…10 часовой экспозицией.

Экстракты, отделяли на делительной воронке, сушили прокаленным сульфатом натрия в течение 30-40 мин., после чего отгоняли растворитель на водяной бане при температуре (75…80)°С. Пары растворителя конденсировали в холодильнике, а сам растворитель собирали в приемник. Полученные остатки после отгонки растворителя помещали в сухожаровой шкаф и при температуре (80…85)°С выпаривали до постоянной массы. Пробы после охлаждения взвешивали с точностью до 0,0001 г и рассчитывали содержание нефтепродуктов. Данные анализа массы остатков нефтепродуктов в опытной и контрольной пробах использовались для расчета степени биологической утилизации (БУ) исследуемой культурой микроорганизмов нефти и мазута по формуле:

БУ = (Мк-Мо)/Мк * 100 % , (1)

где Мк – масса нефтепродукта в исходной (контрольной) пробе (среднее арифметическое параллельных определений);

Мо – масса остатка нефтепродукта в опытной пробе (среднее арифметическое параллельных определений).

Биодеструктивную активность культур оценивали с учетом прироста количества микроорганизмов в культуральной среде и степени биологической утилизации нефтепродуктов (табл. 2-7).

Результаты экспериментов, представленные в табл. 2-7 свидетельствуют, что при отсутствии в синтетической среде углеводородов рост всех культур микроорганизмов отсутствовал, при этом первые 24-48 концентрация микроорганизмов держалась на исходном или близком к нему уровне, а затем наступало интенсивное отмирание бактерий. Внесение в среду нефти или мазута сопровождалось 6-11 кратным увеличением количества бактерий через 72-96 часов культивирования. При этом более интенсивный рост бактерий всех видов отмечался на среде с нефтью.

Таблица 2. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде в отношении нефти

Концентрация перфтордекалина,

%

Концентрация нефти,

%

Исходная Концентрация живых микробов в см3 ´108

 

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после…ч роста на синтетической среде, ´108

Степень утилизации нефти,

%

24

48

72

96

0

0

0,9

0,8

0,8

0,6

0,5

-

1

0,9

1,8

5,4

10,2

9,6

8,6

1

0

0

0

0

0

0

1

0

0,9

1,0

1,1

0,8

0,5

-

1

0,9

7,7

33,5

55,4

47,6

64,5

1

0

0

0

0

0

0

5

0

0,9

1,1

1,2

0,7

0,3

-

1

0,9

9,6

47,2

56,3

42,7

94,2

1

0

0

0

0

0

0



Примечание. С целью большей наглядности результатов мы сочли целесообразным в настоящей таблице и в таблицах 3-8 привести только средние арифметические результаты по 4-6 определениям концентраций живых бактерий и степени утилизации ими нефтепродуктов. Во всех случаях степень отклонения единичного определения от средней арифметической не превышала 15 %.





Таблица 3. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде в отношении мазута

Концентрация перфтор­декалина,

%

Концентрация мазута,

%

Исходная Концентрация живых микробов в см3 ´108

 

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после…ч роста на синтетической среде, ´108

Степень утилиза­ции мазута,

%

24

48

72

96

0

0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

-

1

0,9

1,5

3,9

8,2

8,0

5,8

1

0

0

0

0

0

0

1

0

0,9

1,0

1,0

0,7

0,5

-

1

0,9

6,2

17,3

36,8

40,3

39,7

1

0

0

0

0

0

0

5

0

0,9

1,1

1,1

0,6

0,3

-

1

0,9

8,7

39,5

48,3

39,7

73,5

1

0

0

0

0

0

0







Степень утилизации микроорганизмами нефти за четверо суток колебалась от 4,3 до 8,6%, мазута от 3,9 до 5,8%. Наибольшей биодеструктивной активностью в отношении нефти и мазута обладала культура Pseudomonas putida ВУ186, наименьшей культура Bacillus subtilis ВУ 367. Культура Rhodococcus erythropolis ВУ 321 по степени утилизации нефти и мазута занимала среднее место.

Таблица 4. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Rhodococcus erythropolis ВУ 321 в жидкой синтетической среде в отношении нефти

Концентрация перфтор­декалина,

%

Концентрация нефти,

%

Исходная Концентрация живых микробов в см3 ´108

 

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после…ч роста на синтетической среде, ´108

Степень утилизации нефти,

%

24

48

72

96

0

0

0,8

0,8

0,7

0,6

0,5

-

1

0,8

1,5

3,9

8,2

8,0

6,3

1

0

0

0

0

0

0

1

0

0,8

1,0

1,0

0,6

0,4

-

1

0,8

6,2

17,3

36,8

40,3

39,7

1

0

0

0

0

0

0

5

0

0,8

1,1

1,1

0,5

0,3

-

1

0,8

8,7

39,5

48,3

39,7

73,5

1

0

0

0

0

0

0







Таблица 5. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Rhodococcus erythropolis ВУ 321 в жидкой синтетической среде в отношении мазута

Концентрация перфтор­декалина,

%

Концентрация мазута,

%

Исходная концентрация живых микробов в см3 ´108

 

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после…ч роста на синтетической среде, ´108

Степень утилизации
мазута,

%

24

48

72

96

0

0

0,8

0,8

0,7

0,6

0,5

-

1

0,8

1,5

3,6

7,2

7,3

5,1

1

0

0

0

0

0

0

1

0

0,8

1,0

1,0

0,7

0,5

-

1

0,8

6,0

14,1

26,5

35,6

31,5

1

0

0

0

0

0

0

5

0

0,8

1,0

1,1

0,6

0,3

-

1

0,8

8,2

29,8

35,7

38,7

54,8

1

0

0

0

0

0

0







Внесение в культуральную среду 1 и 5% перфтордекалина во всех случаях, сопровождалось значительным ускорением роста бактерий на синтетической среде с углеводородами нефти и мазута и существенным приростом абсолютного их количества начиная с первых суток культивирования с максимумом на третьи сутки роста. При этом концентрация бактерий через трое суток роста для культуры Pseudomonas putida ВУ186 достигала 5,63*109, что превышало их исходную концентрацию в 60 раз и аналогичный показатель для данного микроорганизма на среде без перфтордекалина в 5,5 раза.

Степень утилизации нефти в средах с содержанием 1 и 5% перфтордекалина у этого микроорганизма достигала 64,5 и 94,2%, соответственно, что в 8,6 и 11 раз превышало утилизацию нефти на среде без перфтордекалина.

Таблица 6. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Bacillus subtilis ВУ 367 в жидкой синтетической среде в отношении нефти

Концентрация перфтордекалина,

%

Концентрация нефти,

%

Исходная Концентрация живых микробов в см3 ´108

 

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после…ч роста на синтетической среде, ´108

Степень утилизации нефти,

%

24

48

72

96

0

0

1,1

1,2

0,9

0,9

0,7

-

1

1,1

1,7

3,5

7,4

7,2

4,3

1

0

0

0

0

0

0

1

0

1,1

1,1

1,2

1,0

0,7

-

1

1,1

3,7

11,5

27,5

33,7

23,9

1

0

0

0

0

0

0

5

0

1,1

1,2

1,1

0,7

0,6

-

1

1,1

6,1

18,4

29,8

32,5

41,6

1

0

0

0

0

0

0



Таблица 7. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Bacillus subtilis ВУ 367 в жидкой синтетической среде в отношении мазута

Концентрация перфтордекалина,

%

Концентрация мазута,

%

Исходная Концентрация живых микробов в см3 ´108

 

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после…ч роста на синтетической среде, ´108

Степень утилизации
мазута,

%

24

48

72

96

0

0

1,1

1,2

0,9

0,9

0,7

-

1

1,1

1,4

3,1

6,4

6,0

3,9

1

0

0

0

0

0

0

1

0

1,1

1,1

1,2

1,0

0,7

-

1

1,1

3,9

14,2

26,4

30,1

20,6

1

0

0

0

0

0

0

5

0

1,1

1,2

1,1

0,8

0,6

-

1

1,1

5,3

12,8

23,5

29,8

37,1

1

0

0

0

0

0

0



Существенное увеличение скорости роста микроорганизмов, абсолютной их концентрации в среде и степени утилизации нефти и мазута наблюдался при добавлении в среду перфтордекалина для всех трех исследуемых культур микроорганизмов родов Pseudomonas, Rhodococcus и Bacillus. При этом прирост их показателей был примерно пропорционален их исходной биодеструктивной активности, определенной в отсутствие перфтордекалина.

Таблица 8. Влияние перфтордекалина на рост культуры Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде с глюкозой

Концентрация перфтор­декалина,

%

Концентрация глюкозы,

%

Исходная Концентрация живых микробов в см3 ´108

 

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после…ч роста на синтетической среде, ´108

24

48

72

96

0

0

0,9

0,8

0,8

0,6

0,5

1

0,9

10,9

26,3

19,2

19,6

1

0

0,9

1,0

1,1

0,8

0,5

1

0,9

16,7

48,2

24,3

18,4

5

0

0,9

1,1

1,2

0,7

0,3

1

0,9

45,3

37,1

19,7

14,5



При выращивании культуры Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде, содержащей перфтордекалин и глюкозу вместо нефти или мазута, интенсивность роста бактерий резко возрастала. При этом пик концентрации живых клеток в культуральной среде с 5% перфтордекалина наблюдался уже через сутки, достигая 4,53*109 живых бактерий с последующим понижением этого показателя через двое, трое и четверо суток. В культуральной среде содержащей 1% перфтордекалина этом пик концентрации живых клеток наблюдался через двое суток культивирования с последующим интенсивным снижением этого показателя через трое и четверо суток. При росте Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде с глюкозой вместо нефти или мазута, но не содержащей перфтордекалин, интенсивность роста бактерий менялась не в столь выраженной форме, однако она также превышала в несколько раз по скорости роста и интенсивности бионакопления аналогичные показатели для данного микроорганизма на средах с нефтью и мазутом. Потребность в кислороде у микроорганизмов растущих на среде с глюкозой составляет 0,7 граммов на 1 грамм абсолютной сухой массы; нефти и топочного мазута - до 3,3 граммов [4].

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о возможности использования ПФОС для наработки биомассы микроорганизмов биодеструкторов с использованием дешевых синтетических сред с добавлением углеводородов нефтепродуктов в качестве источника углерода и энергии. Была показана возможность существенной интенсификации биодеструктивной активности грамположительных и грамотрицательных бактерий разных групп при добавлении в среду культивирования перфтордекалина в концентрациях от 1 до 5%.

Не вызывает сомнений, что интродукция во внешнюю среду активированной подобным образом микрофлоры позволит более эффективно восстанавливать ее экологическое равновесие в зоне хронических загрязнений нефтью и отходами нефтепроизводств, а также ликвидировать последствия техногенных катастроф, сопровождающихся массивным выбросом нефтепродуктов. Полученные данные существенно расширяют возможности использования перфторуглеродов для удаления разнообразных экотоксикантов биотехнологическими методами [7-9].

Литература

1. Использование биогенных добавок совместно с препаратом «Деворойл» для рекультивации нефтезагрязненных почв / Габбасова И.М., Сулейманов Р.Р., Бойко Т.Ф. и др. // Биотехнология. – 2002.- №2. – С. 57 – 65.

2. Эффективные микроорганизмы-нефтедеструкторы для биологической рекультивации почв / Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Артемова С.А. и др.// Тез. докл. 1-го Международного Конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 14-18 октября 2002 г.). – М.:ЗАО Максима», РХТУ им Д. И. Менделеева, 2002. – С.294.

3. Киреева Н.А. // Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Уфа, 1994. – 171 с.

4. Интенсификация процессов очистки воды и почвы от нефтянных загрязнений в присутствии переносчиков кислорода / Курашов В. М., Емельянов В. М., Сахно Т. В. и др. // Тез. докл. 1-го Международного Конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 14-18 октября 2002 г.). – М.:ЗАО Максима», РХТУ им Д. И. Менделеева, 2002. – С. 293 –294.

5. Иваницкий Г. Р. Биофизические основы создания перфторуглеродных сред и газотранспортных кровезаменителей (обзор) //Сборник научных трудов НПФ «Перфторан»: Перфторорганические соединения в биологии и медицине. - Пущино: ПНЦ РАН, 2001. Вып. XI. - С. 4-48.

6. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Алпашкин Р. И. и др. Выделение и изучение прикладных свойств микроорганизмовнефтедеструкторов//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. «Наука-производство-технологии-экология», Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.№3. С. 78-79.

7. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Золотарев А. Г., Кривошеина Н. А. Нужна ли «голубая кровь микроорганизмам»?// МВФ. Медицина. Фармация, 2003, № 2. – С. 7-11.

8. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Кривошеина Н. А. и др. Использование перфторуглеродов для интенсификации процессов микробной деградации нефти и нефтепродуктов//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. «Наука-производство-технологии-экология», Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.№3. С. 80-81.

9. Бакулин М. К., Пименов Е. В., Дармов И. В. Зачем микроорганизмам «голубая кровь»//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. «Наука-производство-технологии-экология», Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.№3. - С. 82-83.