Исследование периферической крови, костного мозга и внутренних органов беспородных белых мышей после плеторического введения оксиэтилкрахмала (ОЭК) и экринола (ЭК)


А.А.Осипов, С.Г.Львов, В.И.Долин.
Астраханская государственная медицинская академия г.Астрахань.

Введение. В связи с использованием перфторорганических соеди­нений (ПФОС) в диспергированном состоянии возникает ряд задач, ре­шение которых необходимо для успешного использования ПФОС в ка­честве переносчика кислорода(3,4). Одна их них - необходимость использования подходящих эмульгаторов, другая - эффективного плазмозаменителя, наконец - нахождение оптимального состава препарата на основе ПФОС (5). Несомненный интерес представляют также иссле­дования, направленные на дальнейшее изучение биологических эффек­тов, возникающих при использовании уже известных эмульсий на осно­ве ПФОС. Как известно, морфологический метод, позволяющий выявить наиболее ранние структурные изменения в органах и тканях экспери­ментальных животных, подвергающихся воздействию различных дозиро­вок апробируемого вещества, является наиболее достоверным (1,2,6).

Целью настоящей работы явилось определение острой токсично­сти ОЭК и ЭК, как возможных плазмозаменителей в составе эмульсий ПФОС по общепринятой методике биологического тестирования на животных.

Материал и методы. Готовые лекарственные формы ОЭК и ЭК поста­влялись С.М.Яровой и Л.П.Гриневой из ВНИИ ТКГП Минмедбиопрома . Все эксперименты на животных выполнялись в ИБФ АН СССР совместно с сотрудниками лаборатории ме­дицинской биофизики.

Опыты с плеторическим введением ОЭК и ЭК проводились на 73 беспородных белых мышах - самцах, массой 25-35 г. В качестве конт­роля использовали интактных мышей - самцов, массой 25-35 г.(30 осо­бей).

Все животные были забиты (с соблюдением принципов эфтаназии) через 4 часа, 24 часа, 3 сут., 5 сут., 7 сут., 10 сут., 15 сут., I мес.,2 мес., 3 мес. после плеторического введения ЭК 9% в дозе 66 мл. на 1 кг. веса в/в и через такие же промежутки времени после плеторического введения ОЭК 6% в дозе 66 мл. на I кг. веса в/в.

В периферической крови мышей определяли количество эритроци­тов, лейкоцитов, тромбоцитов (в 1мкл), подсчитывали лейкоцитарную формулу. В костном мозге подсчитывали миелограмму.

После забоя оценивался внешний вид органов, кровенаполнение; пе­чень, селезенка и почки  взвешивались. Кусочки тканей печени, селе­зёнки, почек, сердца, лёгких, головного мозга, тонкого и толстого кишеч­ника фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону, проводилась ПАС-реакция.

Изменения в периферической крови,
гемограмме и миелограмме после плеторического введения ОЭК.

 Через 4 часа после введения ОЭК количество эритроцитов в 1мкл снижалось более, чем в 2 раза, лейкоцитов в 1,5 раза, несколько уменьшалось количество тромбоцитов. Анемия сохранялась до 5 сут. после введения ОЭК. Полное возвращение количества эритроцитов к норме происходило на 10 сутки. Количество лейкоцитов в 1млк на протяжении от I до 10 суток подвержено значительным коле­баниям; разница показателей, по сравнению с контролем, статистически недостоверна. Максимальное приближение показателей к норме отмечалось на 7 сутки. Количество тромбоцитов в I мкл. сниженное в первые 3-е суток после введения ОЭК, повышалось на 5-7 сутки и нормализовалось к 10 сут­кам.

В 1-е сутки после плеторического введения мышам ОЭК в лейко-грамме отмечался относительный лимфоцитоз (содержание лим­фоцитов повышалось, по сравнению с исходным, в 1,2 раза) и нейтропения. Процентное содержание палочкоядерных и особенно сегментоядерных форм уменьшалось в 1,7 раза. Со стороны других клеток достоверных изменений не обнаруживалось. На 3-и сутки содержание лимфоцитов не отличалось от исходного, а сегментоядерных нейтрофилов - превышало та­ковое до введения в 1,5 раза. Начиная с этого срока и до 10 суток, в периферической крови мышей обнаруживалось до 3% юных нейтрофилов. К концу 2-й недели после опыта процентное содержание различных форм лейкоцитов периферической крови не отличалось от первоначального. К концу второго месяца после опыта в крови выявлялся относительный лимфоцитоз, сохраняющийся до 3-го месяца после введения ОЭК. Приближение показателей к норме происходило к концу третьего месяца.

Изучение миелограммы позволило отметить некоторое снижение бластных клеток в течение первых суток после опыта, затем отмечалась тенденция к нормализации к 7 суткам. Количество миелоцитов и метамиелоцитов, начиная от первых четырёх часов до поздних сроков, после введения ОЭК неуклонно снижалось и оставалось достоверно сниженным вплоть до второго месяца. Палочкоядерные лейкоциты были разделены на клетки с "баранкообразным ядром" (палочки крыс) и обычные. Если в первой группе клеток отмечалась выраженная тенденция к увеличению процентного содержания клеток в миелограмме (в 2 раза превысившего норму к концу первого месяца), то процентное содержание обычных палочкоядерных лейкоцитов на ранних сроках (до 7 суток) было снижено, по сравнению с нормой. Нормализация показателей происходила к концу 10-ых суток (табл. 1).

Таблица 1. Миелограмма костного мозга мышей в различные сроки
после плеторического введения оксиэтилкрахмала (М±м)

Показатель Контроль 4 часа 24 часа 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. 14 сут. 1 мес. 2 мес.
Бласты 3,4±
0,83
1,33±
0,41*
1,67±
1,1
2,5±
0,8
1,0±
0,6*
2,7±
0,7
1,5±
0,6
- - -
Миелоциты 2,.9±
1,1
1,3±
0,4
1,0±
1,2
1,3±
0,8
- - - - - -
Юные 9,6±
1,5
5,3±
0,5*
3,7±
2,1*
11,3±
5,7
1,3±
0,8*
1,0* 1,3±
0,34*
- 0,33±
0,4*
0,5±
0,6*
Палочки "крыс" 15,.2±
4,6
24,0±
3,3
32,0±
3,6*
25,0±
4,2
23,7±
3,6
24,.0±
1,6
23,0±
2,0
- 18,7±
4,3
18,8±
1,9
Палочки 24,78±
3,0
13,0±
5,2
5,3±
1,5*
19,5±
5,4
19,0±
3,3
27,.0±
1,4
22,8±
2,01
- 16,7±
5,4
12,5±
1,1
Сегменты 19,4±
4,.71
18,0±
10,4
11,3±
5,6
10,3±
5,2
36,0±
3,3*
28,3±
2,9
29,0±
1,3
- 29,7±
6,6
33,8±
2,9
Эритробласты 1,6±
0,4
- - - - - - - - -
Нормобласты базофильные 0,67±
0,26
1,1±
0,58
0,67±
0,83
- 0,33±
0,9
- - - - 0,75±
0,59
Моноциты 0,7±
0,1
4,0±
2,2
4,3±
1,7*
2,3±
0,6
1,3±
1,27
0,75±
0,3
1,0±
0,71
- - 0,75±
0,6
Эозинофилы 1,1±
0,2
- - - - - - - 31,3±
0,4
-
Лимфоциты 20,9±
5,4
31,0±
13,0
35,3±
4,4*
28,0±
7,4
16,0±
3,3
16,0 21,0±
3,02
- 31,3±
1,7*
28,3±
1,1

* - достоверное различие с контролем (р < 0,05)

Процентное содержание сегментоядерных нейтрофилов снижалось до 3-х суток, затем на 5-е сутки увеличивалось примерно в 2 раза выше нормы и на 7-10 сутки, а также через 1-2 месяца после введения ОЭК оставалось выше нормы (данные последних сроков статистически недостоверны (табл.  1)).

Процент лимфоцитов через 4 и 24 часа уве­личивался к концу первых суток (статистически достоверное увеличение в 1,5 раза), по сравнению с нормой. Нормализация показателей отмечалась к 10 суткам. На сроках 1-2 мес. отмечалось увеличение процентного содержания лимфоцитов по сравнению с нормой.

Изменения в периферической крови,
гемограмме и миелограмме после плеторического введения ЭК.

Выраженная анемия, отмечаемая на 1-3 сутки после пле­торического введения ЭК, сменялась нормализацией показателей на
7-е
сутки и
, в дальнейшем, на 10-14 сутки изменения количества эритроци­тов в I мкл. не имели определённых закономерностей (показатель оста­вался ниже нормы). Значения показателей на сроках 2-3 мес. были приближены к норме.

Изменения процентного содержания лейкоцитов были так­же лишены определённых закономерностей. Снижение показателя через 4 ча­са после введения ЭК переходило в увеличение к концу I суток; нормализация показателя, достигаемая на 7 сутки, в дальнейшем, на
10-14
сутки, сменялась относительной лейкопенией. Все данные оказались статистически недостоверными.

Изменения процентного содержания тромбоцитов также  отличались определённым непостоянством в тенденциях развития. Снижение показателей через 4 часа после введения ЭК сменялись нормализацией к концу I суток; к 7 суткам отмечался тромбоцитоз (данные статистически достоверны). Нормализация показателей на 10 сутки сменялась их уве­личением к концу 14 суток. Тромбоцитоз отмечался и в конце 2 месяца.

Плеторическое введение ЭК мышам сопровождалось повышением в первые 4 часа после введения процентного содержания лимфоцитов в 1,2 раза, сниже­нием нейтрофилов в 1,8 раза, главным образом, за счёт сегментоядерных форм. Содержание других видов клеток в гемограмме достоверно не изменялось. Через 24 часа наблюдалась обратная картина: процентное содержание лимфоцитов снижалось,  составляя 69% от исходного, а содержание сегментоядерных нейтрофилов возрастало, по сравнению с исходными данными, в 2,1 раза. На 5-7 сутки лейкограмма отличалась от исходной наличием юных форм нейтрофилов, к 10-14 суткам лейкограмма достигла исходного уровня. Интересно отметить значительное уве­личение процента лимфоцитов в лейкограмме к концу 3 месяца после введения ЭК.

Изучение миелограммы выявило уменьшение количества бластных клеток в сроках от 4 часов до 10 суток с нормализацией показателя к 14 суткам. Процентное содержание миелоцитов и метамиелоцитов в срок от 4 часов до 14 суток после введения ЭК было подвержено колебаниям, не носящим определённых закономерностей. Значение по­казателя процентного содержания метамиелоцитов на 14 сутки после введения оказа­лось несколько приближено к норме. Нормализация процентного со­держания метамиелоцитов, достигаемая на I мес., сменялась выражен­ным его уменьшением на 2 месяце, после введения ЭК (табл. 2).

Процентное содержание "палочек крыс" имело тенденцию к неко­торому увеличению на ранних сроках с последующей нормализацией на 7 сутки и с дальнейшим увеличением на 10-14 сутки, оставаясь увеличенным в сроке до 1-2 мес. после введения.

Таблица 2. Миелограмма костного мозга мышей в различные сроки после плеторического введения экринола (М±м)

Показатель Конт­роль 4 часа 24 часа 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. 14 сут. 2 мес. 3 мес.
Бласты 3,4±
0,83
1,67±
0,41
2,67±
1,0
1,0* 0,75±
0,56*
0,5±
0,59*
0,25±
0,26*
3,25±
1,76
авс авс
Миелоциты 2,.9±
1,08
- 1,33±
0,5
- - - - - 2,25±
1,1
-*
Юные 9,55±
1,53
1,0±
0,71*
6,17±
1,2
1,0* 1,0±
0,59*
0,75±
0,56*
3,75±
1,22*
6,75±
3,17
10,3±
3,6
0,5±
0,6*
Палочки "крыс" 15,.2±
4,6
18,0±
2,6*
14,0±
4,52
16,5±
2,20
21,8±
2,0
16,0±
1,3
25,8±
2,9
25,8±
2,2
24,8±
7,7
22,5±
2,7
Палочки 24,78±
3,0
11,3±
0,7*
16,8±
1,7*
20,3±
2,7
24,8±
2,9
23,8±
3,4
12,0±
2,6*
13,5±
2,2*
14,0±
3,3*
17,3±
1,2*
Сегменты 19,4±
4,.71
31,7±
3,2*
11,7±
1,7
39,3±
2,0*
27,8±
4,3
27,3±
3,4
25,8±
7,5
13,0±
2,2
7,5±
2,6*
25,8±
3,8
Эритробласты 1,6±
0,4
- - - - - - - - -
Нормобласты базофильные 0,67±
0,26
1,67±
0,71
1,67±
0,81
2,6±
0,34*
-* 0,25±
0,3
-* -* -* -*
Нормобласты полихромат. 2,67±
1,08
3,0±
1,24
1,33±
0,7
1,0±
0,5
1,0±
0,6
1,5±
0,8
0,5±
0,59*
2,0±
1,13
1,0±
1,2
1,25±
0,3
Моноциты 0,7±
0,1
- - 0,75±
0,6
1,3±
0,6
1,0±
0,6
1,0±
0,8
- - 0,75±
0,9
Эозинофилы 1,1±
0,2
- - - - 0,25±
0,3
- - - -
Лимфоциты 20,9±
5,4
31,6±
5,9
44,3±
3,6*
21,5±
1,9
22,4±
4,2
29,0±
8,9
31,0±
6,5
32,8±
5,2
35,8±
9,5
28,5±
1,9

* - достоверное различие с контролем (р < 0,05)

Процентное содержание обычных палочкоядерных лейкоцитов нормализовалось к 5-7 суткам, но затем уменьшалось, оставаясь достоверно сниженным до 1 мес. после введения.

Процентное содержание сегментоядерных нейтрофилов достигало пи­ка на 3 сутки (увеличение в 2 раза, по сравнению с нормой), на 10-14 сутки приближалось к норме. Отмечалось снижение количества нейтрофилов в 2,5 раза к концу второго месяца после введения ЭК с тенденцией к нормализации к 3 мес.

Изменения красной крови выражались в увеличении числа базофильных нормобластов на 3 сутки после введения ЭК с последующим уменьшением их количества на 7-10 сутки. К 1 и 2 месяцу после введения ЭК отмечалось досто­верное снижение, по сравнению с нормой, числа полихроматофильных и базофильных нормобластов.

Процентное содержание лимфоцитов в костном мозге достигало максимальных величин к 1 суткам (в 2 раза превышало норму), с тенденцией к снижению показателей на 3-5 сутки и увеличению на 10-14 сутки. Статистически недостоверное увеличение ко­личества лимфоцитов в миелограмме сохранялось до 1-2 мес. после введения ЭК.

Таким образом при сравнении эффекта воздействия ОЭК и ЭК сле­дует отметить менее выраженные изменения при введении ОЭК. Восстановление основных показателей периферической крови происходило на 7-10 сутки с отсутствием выражен­ных изменений на поздних сроках, что подтверждается и при изучении миелограммы, исключая выраженный лимфоцитоз в миелограм­ме на сроках 1-2 мес. после плеторического введения ОЭК. При исполь­зовании экринола достигалась лишь частичная нормализация основных показателей клеточного состава периферической крови на 5-7 сутки, в дальнейшем сменяемая трудноподдающимися объяснению колебаниями показателей, особенно выраженными при подсчёте количества тромбо­цитов. Изменения в миелограмме на поздних сроках после плетори­ческого введения ЭК характеризовались некоторым угнетением красного ростка, более выраженным, чем при введении ОЭК.

Морфология внутренних органов беспородных белых мышей
после плеторического введения ОЭК и ЭК.

Основные морфологические изменения после введения экринола и оксиэтилкрахмала однотипны, в основном проявляются в печени, селезёнке и почках (табл. 3). Они связаны с вакуолизацией гепатоцитов и клеток Купфера, макро­фагов и эндотелия сосудов селезенки, эпителия проксимальных и дистальных отделов канальцев почек. В вакуолях определялась положительная ПАС-реакция от слабо выраженной
(4
часа - 1 сутки) до выраженной (трое суток) и затем умеренной и слабой (5-7 суток).
 

 

Таблица 3.  Динамика изменения массы внутренних органов  мышей при плеторическом введении OЭК и ЭК .( в   мг).

органы Время эксперимента
Интактные животные 4 час 24 час 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10-11 сут. 15-17 сут. 2 мес. 3 мес.
печень 1360±
114
1977±
152
2022±
53
1892±
72
1900±
49
1800±
113
1770±
98
1450±
106
1400±
58
1420±
37
селезёнка 152±
31
218±
23
186±
13
186±
16
190±
26
187±
20
160±
18
165±
51
158±
27
160±
30
почки 173±
35
240±
42
235±
34
240±
50
231±
26
225±
16
200±
18
181±
24
177±
28
180±
17
Количество животных n=30 n=10 n=10 n=10 n=10 n=10 n=10 n=8 n=7 n=8

Кроме того, во всех внутренних органах наблюдались расстройст­ва кровообращения в виде расширения артериол, капилляров, стаза, отёка, в отдельных местах диапедезных периваскулярных кровоизлияний (от 4 часов до 5-7 суток после введения ОЭК и ЭК), а также круглоклеточная периваскулярная инфильтрация и высоко положительная ПАС-реакция в про­свете канальцев почек (на 7-15 сутки после введения).

Через 0,5-1 мес. после введения изменений, связанных с накоплением ОЭК и ЭК в паренхиме печени, почек и селезёнки мышей, не определялось. Данные органы в этот период по морфологии соответствовали таковым у интактных животных.

Таким образом, большая часть вводимого продукта выделялась через почки, незначительное количество накапливалось как в периваскулярных пространствах почек, селезёнки, печени, так и в системе мононуклеарных фагоцитов этих органов, и ещё меньшая часть -  в паренхиме печени. В данных органах происходили дистрофические из­менения, но значительных повреждений не обнаруживалось. В течение
7-14 суток после введения происходило постепенное выведение ОЭК и ЭК из паренхимы органов (образование периваскулярных гранулем) и в дальнейшем выведение их почками. По всей видимости, при плеторическом введении ОЭК и ЭК изменения в органах связаны не столько с токсичностью вводимого продукта, сколько с большой дозой введения его и увеличением ОЦК (гиперволемией).


  Литература:

  1. Васильев А.Э., Львов С.Г., Осипов А.А. Сравнительная морфологическая характеристика внутренних органов кроликов после плеторического введения перфторана и перфукола.// Перфторуглеродные активные среды для медицины и биологии (новые аспекты исследований).- Сборник научных трудов под редакцией Иваницкого Г.Р., Воробьева С.И. Пущино. 1993, с. 196-201.
  2. Голубев А.М. Итоги и перспективы изучения влияния фторуглеродных кровезаменителей на биологические системы.// Там же, с.86-93.
  3. Иваницкий Г.Р., Воробьёв С.И. Инженерия искусственных плазмо­замени­телей крови с газотранспортной функцией на основе перфторуглеродных эмульсий.// Там же с.5-53.
  4. Крылов Н.Л., Белоярцев Ж.Ф., Мороз В.В. .Бобровский Р.Б., Симоненко З.С., Макаров К.Н., Кнунянц И.Л. Опыт применения фторуглеродных оксигенаторов в клинической практике.// Фторуглеродные газопереносящие среды. - Сборник научных трудов под редакцией Ф.Ф. Белоярцева. Пущино.1984, с. 5-17.
  5. Матвеев А.Б., Осипов А.А., Вереина Т.Л., Львов С.Г., Кузнецова Л.Н., Блохин А.Н., Покровский Ю.Э. Изучение влияния фторуглеродных эмульсий и их компонентов на биологические системы (заключительный отчёт)// Депонировано в ВНТИЦ ГККТ инв. № 02900016240, № Гос. регистрации 01.86.007854, Астрахань 1990, 183 с.
  Осипов А.А, Львов С.Г. Морфогистохимическая характеристика миокарда при экспериментальном инфаркте у собак с предварительным введением перфторана и солевой композиции.// Труды I съезда Российского общества патологоанатомов, М. 1996 с. 162-163